技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种芦竹愈伤组织再生植株的方法。

背景技术

芦竹(Arundo donax Linn.)，属于单子叶植物，是禾本科芦竹属中一种多年生常绿高大丛生的草本植物。芦竹种植既可固土护堤，又可美化和保护湿地生态环境。Guo等(2011)研究表明芦竹对污染土壤中As，Cd，Pb和Zn有一定的稳定和去除作用，Han等(2005)进行了利用芦竹修复重金属污染湿地的研究。

包括芦竹在内的植物对污染的修复研究和应用是现在的一个热点。但是，自然界很难找到超级污染修复植物。为了获得理想的修复效果，基因工程育种改造植物使之具有超级修复能力，从而获得良好的修复效果是一种可行的办法。

基因工程改造单子叶植物必须具备的一个前提是组培再生体系，其中愈伤组织再生体系是理想的途径。

Ran等(1998)报道了芦竹组培快繁的研究，但是，愈伤组织再生体系未见相关报道及专利申请。因此，本发明为基因工程改造污染修复植物芦竹提供了前提，为相关研究奠定了基础。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种芦竹愈伤组织再生植株的方法，以建立起一种高效的芦竹再生体系。

本发明解决所述技术问题的方案是：一种芦竹愈伤组织再生植株的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)愈伤组织的诱导：将芦竹组织切割成小块接种于2，4-D1.0～5.0mg/l培养基中，基本培养基为MS培养基，培养温度为25±1℃，接种后暗培养3d，然后于光周期为16小时光照8小时黑暗、光照强度为2000Lx条件下培养，2个月后，形成愈伤组织；愈伤组织的诱导一般是暗培养，发明人发现芦竹愈伤组织的诱导需要光照，在暗培养3d后给予光周期为16小时光照8小时黑暗、光照强度为2000Lx条件下培养，诱导效果好；

(2)愈伤组织的继代培养：将愈伤组织切成小块接种于含2，4-D5.0mg/l培养基中，进行继代培养，1个月重复继代一次，继代培养的基本培养基和培养条件与愈伤组织诱导的基本培养基和培养条件相同；

(3)愈伤组织植株再生：以MS培养基为基本培养基，添加IBA0.5mg/l和6-BA5.0mg/l，接种继代培养2周后的愈伤组织，进行植株再生诱导培养，1个月后可观察到植株再生，培养得到的植株长到1厘米左右时，进行分株壮芽培养；

(4)壮芽培养：将植株转入MS不添加任何激素的培养基中，进行壮芽培养1个月；

(5)生根培养：壮芽后植株下端用锋利的刀片平切，露出维管束组织，立即接种于MS添加NAA0～0.5mg/L的培养基中生根；

(6)移栽：生根后的植株，清洗掉附着于表面的培养基，进行移栽。

作为改进，所述步骤(1)中的芦竹组织为芦竹的无菌苗。

芦竹的无菌苗可以采用2013年2月13日公开的、申请号为201210450391.8的发明创造提供的方法得到。

作为进一步改进，所述步骤(2)中的愈伤组织为颗粒状乳白色的愈伤组织。

由步骤(1)得到的愈伤组织，呈淡黄色、乳白色、白色等颜色，颗粒状乳白色的愈伤组织与特定的IBA和6-BA浓度配合，分化率最高，得到的植株质量最好。

作为更进一步改进，所述步骤(5)中的培养基为MS添加NAA0.1mg/L。

使用本方案的培养基，根的诱导率达90％以上，平均根长达4厘米左右。

本发明的有益效果：建立了一种利用芦竹愈伤组织再生植株的方法，可以在短时间内实现芦竹的高效再生，有利于优良芦竹的扩繁，并为农杆菌介导的芦竹基因工程提供了有效的组培体系。

具体实施方式

实施例1

一种芦竹愈伤组织再生植株的方法，包括如下步骤：

(1)愈伤组织的诱导：芦竹无菌苗去掉叶片，基部组织及幼嫩上端组织，将芦竹无菌苗组织切割成小块接种于2，4-D1.0mg/l培养基中，每小块的长度约为0.3厘米，基本培养基为MS培养基，培养温度为25±1℃，接种后暗培养3d，然后于光周期为16小时光照8小时黑暗、光照强度为2000Lx条件下培养。在诱导前期1星期左右，笔直的茎段开始弯曲，表皮变得疏松。20d左右，茎段上长出少量颗粒状的愈伤组织。2个月后，可以发现成堆的愈伤组织，但出愈率为30％左右；

(2)愈伤组织的继代培养：取颗粒状乳白色的愈伤组织，将其切成小块接种于含2，4-D5.0mg/l培养基中，每小块的长度约为0.5厘米，进行继代培养，1个月重复继代一次，继代培养的基本培养基和培养条件与愈伤组织诱导的基本培养基和培养条件相同；

(3)愈伤组织植株再生：以MS培养基为基本培养基，添加IBA0.5mg/l和6-BA5.0mg/l，接种继代培养2周后的愈伤组织，进行植株再生诱导培养；IBA0.5mg/l和6-BA5.0mg/l使愈伤组织的分化率高，芽成簇生长，生长状况良好。1个月后可观察到分化出绿色嫩芽，在相同培养基上继续培养1个月后待幼嫩植株长到1厘米左右时，进行分株壮芽培养。

(4)壮芽培养：将植株转入MS不添加任何激素的培养基中，进行壮芽培养1个月，1个月后可观察到植株明显粗壮，植株平均高度在3厘米以上。

(5)生根培养：壮芽后植株下端用锋利的刀片平切，露出维管束组织，立即接种于MS培养基中生根，不添加NAA，培养1个月左右可以观察到根系再生，根的诱导率为70％，平均根长2.5厘米。

(6)移栽：生根后的植株，清洗掉附着于表面的培养基，进行移栽。移栽成活率接近100％。

实施例2

一种芦竹愈伤组织再生植株的方法，包括如下步骤：

(1)愈伤组织的诱导：芦竹无菌苗去掉叶片，基部组织及幼嫩上端组织，将芦竹无菌苗组织切割成小块接种于2，4-D2.0mg/l培养基中，每小块的长度约为0.3厘米，基本培养基为MS培养基，培养温度为25±1℃，接种后暗培养3d，然后于光周期为16小时光照8小时黑暗、光照强度为2000Lx条件下培养，2个月后，形成愈伤组织，出愈率为70％左右；

(2)愈伤组织的继代培养：取颗粒状乳白色的愈伤组织，将其切成小块接种于含2，4-D5.0mg/l培养基中，每小块的长度约为0.5厘米，进行继代培养，1个月重复继代一次，继代培养的基本培养基和培养条件与愈伤组织诱导的基本培养基和培养条件相同；

(3)愈伤组织植株再生：以MS培养基为基本培养基，添加IBA0.5mg/l和6-BA5.0mg/l，接种继代培养2周后的愈伤组织，进行植株再生诱导培养，1个月后可观察到植株再生，培养得到的植株长到1厘米左右时，进行分株壮芽培养；

(4)壮芽培养：将植株转入MS不添加任何激素的培养基中，进行壮芽培养1个月，1个月后可观察到植株明显粗壮，植株平均高度在3厘米以上。

(5)生根培养：壮芽后植株下端用锋利的刀片平切，露出维管束组织，立即接种于MS添加NAA0.1mg/L的培养基中生根，培养1个月左右可以观察到根系再生，根的诱导率为90％，平均根长4厘米。

(6)移栽：生根后的植株，清洗掉附着于表面的培养基，进行移栽。移栽成活率接近100％。

实施例3

一种芦竹愈伤组织再生植株的方法，包括如下步骤：

(1)愈伤组织的诱导：芦竹无菌苗去掉叶片，基部组织及幼嫩上端组织，将芦竹无菌苗组织切割成小块接种于2，4-D4.0mg/l培养基中，每小块的长度约为0.3厘米，基本培养基为MS培养基，培养温度为25±1℃，接种后暗培养3d，然后于光周期为16小时光照8小时黑暗、光照强度为2000Lx条件下培养，2个月后，形成愈伤组织，愈伤组织呈淡黄色、乳白色、白色等颜色，颗粒状乳白色的愈伤组织占60～70％左右，出愈率为100％；

(2)愈伤组织的继代培养：取颗粒状乳白色的愈伤组织，将其切成小块接种于含2，4-D5.0mg/l培养基中，每小块的长度约为0.5厘米，进行继代培养，1个月重复继代一次，继代培养的基本培养基和培养条件与愈伤组织诱导的基本培养基和培养条件相同；

(3)愈伤组织植株再生：以MS培养基为基本培养基，添加IBA0.5mg/l和6-BA5.0mg/l，接种继代培养2周后的愈伤组织，进行植株再生诱导培养，1个月后可观察到植株再生，培养得到的植株长到1厘米左右时，进行分株壮芽培养；

(4)壮芽培养：将植株转入MS不添加任何激素的培养基中，进行壮芽培养1个月；1个月后可观察到植株明显粗壮，植株平均高度在3厘米以上。

(5)生根培养：壮芽后植株下端用锋利的刀片平切，露出维管束组织，立即接种于MS添加NAA0.3mg/L的培养基中生根，培养1个月左右可以观察到根系再生，根的诱导率为50％，平均根长3.5厘米。

(6)移栽：生根后的植株，清洗掉附着于表面的培养基，进行移栽。移栽成活率接近100％。

实施例4

一种芦竹愈伤组织再生植株的方法，包括如下步骤：

(1)愈伤组织的诱导：芦竹无菌苗去掉叶片，基部组织及幼嫩上端组织，将芦竹无菌苗组织切割成小块接种于2，4-D5.0mg/l培养基中，每小块的长度约为0.3厘米，基本培养基为MS培养基，培养温度为25±1℃，接种后暗培养3d，然后于光周期为16小时光照8小时黑暗、光照强度为2000Lx条件下培养，2个月后，形成愈伤组织，愈伤组织呈淡黄色、乳白色、白色等颜色，淡黄色、乳白色的愈伤组织占较大比例，出愈率为100％；

(2)愈伤组织的继代培养：取颗粒状乳白色的愈伤组织，将其切成小块接种于含2，4-D5.0mg/l培养基中，每小块的长度约为0.5厘米，进行继代培养，1个月重复继代一次，继代培养的基本培养基和培养条件与愈伤组织诱导的基本培养基和培养条件相同；

(3)愈伤组织植株再生：以MS培养基为基本培养基，添加IBA0.5mg/l和6-BA5.0mg/l，接种继代培养2周后的愈伤组织，进行植株再生诱导培养，1个月后可观察到植株再生，培养得到的植株长到1厘米左右时，进行分株壮芽培养；

(4)壮芽培养：将植株转入MS不添加任何激素的培养基中，进行壮芽培养1个月；1个月后可观察到植株明显粗壮，植株平均高度在3厘米以上。

(5)生根培养：壮芽后植株下端用锋利的刀片平切，露出维管束组织，立即接种于MS添加NAA0.5mg/L的培养基中生根，培养1个月左右可以观察到根系再生，根的诱导率为40％，平均根长4.0厘米

(6)移栽：生根后的植株，清洗掉附着于表面的培养基，进行移栽。移栽成活率接近100％。