（一）技术领域

本发明涉及一种DNA分子鉴定方法，特别涉及中药湖北麦冬PCR 鉴定试剂盒、特异性引物、模板及鉴定方法。

（二）背景技术

湖北麦冬（Liriope spicata var.prolifera）主产于湖北襄樊市，是湖北 道地药材以及国家地理标志性产品，具有养津生阴、清心润肺的功效，在 临床上应用广泛。湖北麦冬由于生长周期短，年产量高，其销量已经占到 麦冬总销量的六成以上，成为当前麦冬类药材的主流品种。除了湖北麦冬 外，药典记载的麦冬主要品种包括浙麦冬和川麦冬，药典记载外的麦冬品 种包括以麦冬或野麦冬为名的沿阶草属18种和山麦冬属8种。我国麦冬 类植物资源丰富，麦冬品种繁多，产地不一，各品种间的药效和价格差别 较大，对麦冬主流产品湖北麦冬进行鉴定具有重要意义。湖北麦冬与其他 品种的外观和性状相似，利用常规的中药鉴定方法较难进行鉴别。利用 DNA分子鉴定方法能够解决湖北麦冬鉴别困难的问题，这种基于DNA 序列的鉴定方法能够从基因水平上进行品种的甄别，具有准确、高效、重 复性好的诸多优点，鉴定的结果不受样品产地、生长环境和来源的影响。

本发明提供的PCR检测法就是一种湖北麦冬的DNA分子鉴定方法， 能够准确鉴定湖北麦冬。目前已有的对湖北麦冬做出准确鉴定的方法均为 采用传统的中药鉴定手段，利用PCR检测法对湖北麦冬进行鉴定尚未见 报道。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种能够准确鉴定中药湖北麦冬的PCR鉴定试剂 盒和检测方法，包括PCR检测法关键试剂PCR引物、模板和PCR检测 法的检测步骤。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种湖北麦冬PCR鉴定试剂盒，所述试剂盒中的特异性 引物为HM1和HM2：

HM1：5'-GCAGGAGGATAGCAGTGTTG-3'，

HM2：5'-CCTGTAGTGGAAGAGGTGCC-3'。

进一步，所述的湖北麦冬PCR鉴定试剂盒的组成为：

本发明还涉及一种利用所述湖北麦冬PCR鉴定试剂盒对湖北麦冬进 行鉴定的方法，所述方法为：

（1）模板DNA的提取和质量鉴定：采用常规提取法提取供试品DNA 作为PCR的模板；以电泳法检测模板DNA的质量（检测方法同步骤（3））， 条带清晰无弥散的，即为符合PCR反应的模板DNA；

（2）PCR鉴定：利用湖北麦冬PCR鉴定试剂盒中的特异性引物HM1 和HM2，进行PCR扩增：

PCR反应溶液：

将PCR反应溶液放入PCR自动扩增仪器中进行PCR扩增反应，反 应程序设置为：94℃预变性3min，94℃变性15s，60～65℃复性30s，72℃ 延伸1min，45个循环，最后72℃延伸7min；

（3）PCR产物进行电泳检测：取出PCR扩增产物（即扩增反应后 的反应液）5μL与加样缓冲液1μL混合，用1.2%琼脂糖凝胶电泳（含0.5% 溴化乙锭）检测扩增结果，在620bp处出现扩增条带的为湖北麦冬，在 620bp处不出现扩增条带的不是湖北麦冬。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：（1）本发明根据凝 胶电泳在620bp处有无扩增条带作为鉴定湖北麦冬的依据，可以检测单个 或者混合麦冬DNA样品，检测准确、灵敏度高、操作简单、耗时短、重 复性好；（2）利用湖北麦冬PCR鉴定试剂盒中引物HM1和HM2以及PCR 反应溶液配方可以制造湖北麦冬鉴定试剂盒；（3）本发明提供了一种快 速、准确鉴定湖北麦冬的方法，可以广泛应用于湖北麦冬中药选种育种、 种植、采收储存、销售、临床应用各环节的品种鉴定，在鉴别中药真伪， 打击伪品，加强中药质量监管，促进中药现代化发展方面具有重大意义。

（四）附图说明

图1为十四种供试品经PCR检测法鉴定后的电泳图，泳道1～14分别 为湖北麦冬、川麦冬、浙麦冬、上海麦冬、蒜、小葱、洋葱、韭菜、黄精、 吊兰、百合、万年青、浙贝母、白术，泳道M为marker。

图2为不同浓度的湖北麦冬经PCR检测法鉴定后的电泳图，泳道M 为Marker，泳道1为0.05ng/μL，泳道2为0.5ng/μL，泳道3为5ng/μL。

图3为混合样品经PCR检测法鉴定后的电泳图，泳道1为川麦冬、 浙麦冬、上海麦冬的DNA混合溶液，泳道2为湖北麦冬、川麦冬、浙麦 冬、上海麦冬的DNA混合溶液，泳道M为marker。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

实施例1

1、湖北麦冬PCR检测法关键试剂PCR引物的获得

应用CTAB提取法从湖北麦冬、川麦冬、浙麦冬、上海麦冬中分别 提取基因组DNA。使用RAPD扩增法对四种麦冬进行RAPD分析，筛选 获得一条湖北麦冬特异性扩增条带，这条特异性扩增条带只出现在湖北麦 冬品种中，在其他麦冬品种中没有，此条带中的DNA分子即是湖北麦冬 特异性DNA分子标记。将湖北麦冬特异性DNA分子标记从琼脂糖凝胶 中回收、克隆、测序，测序结果见SEQ ID NO.1所示，命名为HM636。

根据HM636序列，设计一对特异性引物HM1和HM2，引物序列为

HM1：5'-GCAGGAGGATAGCAGTGTTG-3'，

HM2：5'-CCTGTAGTGGAAGAGGTGCC-3'。

上下游引物选取的位点分别对应于HM636序列位点上的2～21和 602～621。

SEQ ID NO.1为：

5'-AGCAGGAGGATAGCAGTGTTGATATTTATGCAGCAGAGTTCCTCCGTTTGAGC  AGGTTTGCTCCGTCTAGGGTAGCAGTTGAGGCTGACAGGGCAAATCGATTTCTG  GAGGGTTTGAAGCTTGAGATCCAGAAGTTGATAGCCTCCCAGGATTTGGATACC  TATGCCAAGGTGATTACGGCGGCCCGTCATACAGAGGTAGTTCTACAAAGAGAG  ACAGCTCAGTCAGGGGCACAGCAGAGACAGGCAGGGCCAGTAAAGTGGCCGT  TTGGTCAGGCTTTTGGACAGCAGCAGAGGACTGGGCAGGTACCCCGACCAGCA  GTGCCATGGCAGAGACAGGGTCAGAGAGTGCCAGTTTGTGTTTTCTGTCACCAA  CCAGGGCATCTACAGAGGGAGTGCATGAGGAGGACCGGGGCTTGTTTGATCTGT  GGAGCTTTAGACCATCAGGCCTTCCAGTGTCCGATGGGCAGAGCACCGCAGGG  AGCTAGAGAACCGGCTCCACCCGTACAGCAGCAGCAGCGACCACCAGCACCAG  CCGCAGCACAGGTCAGACCACCGACAGTACCAGCAGGTCAGGGGCAGGCAGTT  CAGGCAGTACTGAGGGCACCTCTTCCACTACAGGATATTGCTTTCGGAG-3'

2、湖北麦冬的PCR检测法

（1）采用常规提取法提取供试品DNA作为PCR的模板；以电泳法 （同步骤（3））检测模板DNA的质量，条带清晰无弥散的，即为符合PCR 反应的模板DNA；

（2）按照HM1和HM2的序列用体外合成仪合成引物HM1和HM2。 以HM1和HM2为引物进行PCR扩增。

按照下述配方配置PCR反应溶液：

将PCR反应溶液放入PCR自动扩增仪器中进行PCR扩增反应，反 应程序设置为：

94℃预变性3min，94℃变性15s，60～65℃复性30s，72℃延伸1min， 45个循环，最后72℃延伸7min。

（3）PCR产物进行电泳检测：取出PCR扩增后的反应液5μL与加 样缓冲液1μL混合，用1.2%琼脂糖凝胶电泳（含0.5%溴化乙锭）检测扩 增结果，在620bp处出现扩增条带的样品为湖北麦冬，在620bp处不出 现条带的样品不是湖北麦冬。

实施例2：

1、湖北麦冬PCR检测法的准确性研究

从湖北麦冬、川麦冬、浙麦冬、上海麦冬、蒜、小葱、洋葱、韭菜、 黄精、吊兰、百合、万年青、浙贝母、白术这14种植物中提取基因组DNA。 以上述14种品种的基因组DNA为模板，利用特异性引物“HM1/HM2” 进行PCR扩增，PCR反应液、扩增程序、检测方法同实施例1，只是更 换DNA模板，以验证湖北麦冬PCR检测法的准确性和可靠性，结果见 图1所示，泳道1～14分别为湖北麦冬、川麦冬、浙麦冬、上海麦冬、蒜、 小葱、洋葱、韭菜、黄精、吊兰、百合、万年青、浙贝母、白术，泳道 M为marker。

图1表明，湖北麦冬在620bp处具有特异性的扩增条带，而其他品 种没有。本发明的湖北麦冬PCR检测法经实验证明可以用于湖北麦冬的 鉴定，方法准确性高，简单、效率高、重复性好。

2、湖北麦冬PCR检测法的灵敏度研究

将原始湖北麦冬模板DNA浓度（50ng/μL）经三个梯度进行稀释， 配置三份不同浓度的湖北麦冬基因组DNA溶液：一份浓度为原始湖北麦 冬模板DNA浓度的10%，即5ng/μL；一份浓度为原始湖北麦冬模板DNA 浓度的1%，即0.5ng/μL；一份浓度为原始湖北麦冬模板DNA浓度的1‰， 即0.05ng/μL。

分别以这三种不同浓度的湖北麦冬基因组DNA作为模板（1.2μL）， 以“HM1/HM2”为引物进行PCR扩增，PCR反应液、扩增程序、检测 方法同实施例1，以验证湖北麦冬PCR检测法的灵敏度，结果见图3所 示，泳道M为Marker，泳道1为0.05ng/μL，泳道2为0.5ng/μL，泳道3 为5ng/μL。

结果显示当湖北麦冬模板基因组DNA浓度为原始模板标准浓度的 1‰，即含量仅为0.05ng时，在620bp处依然出现湖北麦冬的特异性条带， 经过多次重复验证，结果保持稳定，证明本发明提供的湖北麦冬PCR检 测法灵敏度很高，含量极微弱的湖北麦冬也能够鉴定出来。

3、湖北麦冬PCR检测法对混合样品的鉴定效果

配置两份不同的基因组DNA混合溶液：组1为川麦冬、浙麦冬、上 海麦冬的DNA混合溶液，三者等量加入，浓度各为原先浓度（50ng/μL） 的三分之一；组2为湖北麦冬、川麦冬、浙麦冬、上海麦冬的基因组DNA 混合溶液，四者等量加入，浓度各为原先浓度（50ng/μL）的四分之一。

将这两份不同的DNA混合液分别作为模板，以“HM1/HM2”为引 物进行PCR扩增，PCR反应液、扩增程序、检测方法同实施例1，以研 究湖北麦冬PCR检测法对混合样品的鉴定效果。实验结果见图3，泳道 M为Marker，泳道1为组1，泳道2为组2。

图3表明，组1没有加入湖北麦冬的混合样品经PCR检测后，结果 显示在620bp处没有出现扩增条带。组2加入湖北麦冬的混合样品经PCR 检测后，结果显示在620bp处出现了明亮的条带，湖北麦冬在四种麦冬 的混合材料中被很好的鉴定了出来。经过多次重复验证，结果保持稳定， 这显示出本发明的湖北麦冬PCR检测法具有极高的准确性，能在混合药 材样品中鉴定出湖北麦冬。实验证明这种方法不仅可以检测单个湖北麦冬 样品，还可以在混合物中检测出湖北麦冬，应用范围较广。