技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种红色红曲霉（Monascus ruber）谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase；GAD）基因编码区核苷酸全序列及其合成方法和对应的蛋白质。

背景技术

谷氨酸脱羧酶(Glutamate Decarboxylase，GAD；EC4.1.1.15）催化L-谷氨酸的α位脱羧反应，生成重要的抑制性神经递质γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid，GABA），GAD是催化谷氨酸脱羧生成GABA的关键限速酶。已有研究表明：GABA是一种生理活性成分，具有抗焦虑、抗惊厥、降血压、增加神经营养、改善脑机能、促进长期记忆、促进生长激素分泌、活化肾功能、肝功能等多种生理功能，具有很好的医药应用前景。同时又是一种新型食品活性因子，在功能食品中的应用已成为研究热点，近年来，富含GABA的食品开发受到重视。GAD酶还有望作为诊断酶来区分预测糖尿病以及作为极具潜力的诊疗型酶制剂；此外，GAD酶对生物在逆境中生存也有重要意义。

GAD酶广泛分布于从植物、动物到单细胞微生物中，如南瓜、茶叶、马铃薯块茎、豇豆、鼠脑、兔脑等中已发现或纯化得到GAD酶，大肠杆菌（Escherichia coli）、酒曲（Koji）、多种乳酸菌如短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、乳链球菌（Lactococcus lactis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）等微生物细胞中也发现有GAD酶的存在，虽然已经筛选到一些高产的GABA的乳酸菌、曲霉等菌株，并证明其具有GAD酶活性，但目前国内外还没有对红曲霉（Monascus）GAD酶有专门研究的报道。

降落PCR（Touchdown PCR），一种PCR技术，主要用于PCR的条件的优化。在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行，例如特异性不够易错配等。退火温度过高会使PCR效率过低，但退火温度过低则会使非特异扩增过多。这虽然可以通过反复尝试来优化，但费时费力。降落PCR提供了一个较为简易的优化方法。其原理大致是这样的。首先在较高的温度下扩增，此时虽然扩增效率低，但非特异扩增基本没有。随着退火温度的降低，非特异扩增会逐步增多。但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势，因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制，从而大幅提高PCR的特异性和效率。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的第一个目的是提供红色红曲霉GAD基因的cDNA核苷酸；本发明的第二个目的是提供上述核苷酸对应的蛋白质；本发明的第三个目的是提供用于上述的核苷酸合成的引物；本发明的第四个目的是提供一种上述核苷酸的合成方法。本发明的红色红曲霉GAD基因的cDNA核苷酸既可用于1型糖尿病的免疫预测和早期诊断，又可利用其生物催化作用制备GABA，具有多重用途和广阔应用前景。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

红色红曲霉（Monascus ruber）谷氨酸脱羧酶基因编码区核苷酸，该核苷酸的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

上述的核苷酸对应的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：

降落PCR扩增所述的核苷酸的引物，上游引物为：5’-ATGGTYCAYCTYGCYMVRGTBMASMSCGC-3’；下游引物为5’-YTARCAAACNCCRTGVGTCTTRCC-3’。

为了实现上述的第四个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种上述的核苷酸的合成方法，该方法包括以下的步骤：

1）提取红色红曲霉RNA；

2）将红色红曲霉RNA反转录合成cDNA；

3）以cDNA作模板，以设计好的上下游简并引物进行降落PCR扩增；

4）将PCR产物进行回收、纯化，获得所述的核苷酸。

本发明运用降落PCR等技术，克隆红色红曲霉的谷氨酸脱羧酶（GAD）基因的cDNA编码区核苷酸全长序列，既可用于1型糖尿病的免疫预测和早期诊断，又可利用其生物催化作用制备GABA，具有多重用途和广阔应用前景。

附图说明

图1为红色红曲霉PDA平板培养15d的菌落。

图2为红色红曲霉总RNA凝胶电泳检测结果。

图3为本发明cDNA的降落PCR产物电泳图。

图4为红色红曲霉GAD氨基酸序列系统进化树。

具体实施方式

实施例1红色红曲霉总RNA提取及cDNA合成

1.1培养基、菌株及试剂盒

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂20g；蒸馏水1000mL；pH6.0。用于红色红曲霉的培养。

红色红曲霉（Monascus ruber）为本微生物筛选的高产γ-氨基丁酸的红色红曲霉MR-5菌株（申请号：200810061419.2申请日：2008-05-09），其保藏编号为:CCTCC NO:M208043,保藏地为:中国典型培养物保藏中心。

真菌RNA提取试剂盒为Omega公司的E.Z.N.A.^TM Fungal RNA Kit。

1.2方法

1.2.1总RNA提取

①取培养15d的红色红曲霉平板2-3个，挑取菌丝到盛有液氮的研钵中研磨至粉末。

②取100mg菌丝粉末到1.5mL离心管，立即加入500μL Buffer RB/2-巯基乙醇并混匀。

③吸取上述溶解液到Homogenization Spin Column（试剂盒提供）中，室温下13,000×g离心5min。

④吸取上清液到新的1.5mL离心管中，加入1/2体积无水乙醇，最大转速漩涡混合15s。

⑤将混合液全部吸到HiBind RNA Mini Column（试剂盒提供）中，并置于试剂盒提供的2mL收集管上，室温下10,000×g离心30s，弃上清。

⑥加500μL RNA Wash BufferⅠ，室温下10,000×g离心30s。

⑦把HiBind RNA Mini Column置于新的2mL收集管中，加入700μL RNA Wash BufferⅡ（稀释后），室温下10,000×g离心30s，弃上清。

⑧加入500μL RNA Wash BufferⅡ清洗吸附柱，室温下10,000×g离心30s，弃上清，20,000×g离心1min，使HiBind基质完全干燥。

⑨将HiBind RNA Mini Column转到1.5mL离心管中，用50μL DEPC水洗脱，最大转速离心1min。

1.2.2cDNA合成

以5-oligo（5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’）和3-CDS

（5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’）为上下游引物，使用Promega M-MLV Reverse Transcriptase反转录合成cDNA，操作如下：

先在70℃金属浴中放5min，再在冰上放置5min。

加入上表组分，在37℃水浴中放置1h即完成cDNA的合成。

1.3结果

红色红曲霉活化后接到PDA平板上，28℃培养15d（图1），收集菌丝体，用于总RNA的提取。

提取的红色红曲霉总RNA，用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测（图2），总RNA的18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三条带非常清晰，28S和18S两条带非常亮，且28s rRNA的亮度大约为18s rRNA的两倍，说明提取的RNA质量较高。

以总RNA为模板，5-oligo和3-CDS为上下游引物，反转录合成cDNA，用微量核酸检测仪检测cDNA浓度。

实施例2降落PCR和产物回收、纯化

2.1方法

2.1.1降落PCR

以设计好的上下游简并引物进行降落PCR扩增。

上下游简并引物的序列如下：

上游引物为：5’-ATGGTY(C/T)CAY(C/T)CTY(C/T)GCY(C/T)M(A/C)V(G/A/C)R(A/G)GTB(G/T/C)M(A/C)AS(G/C)M(A/C)S(G/C)CGC-3’；下游引物为5’-Y(C/T)TAR(A/G)CAAACN(A/T/C/G)CCR(A/G)TGV(G/A/C)GTCTTR(A/G)CC-3’。

PCR反应体系（25μL）：10×LA Taq buffer（Mg2+plus）2.5μL、dNTP Mixture4μL（2.5mM each）、上下游引物各1μL、cDNA模板1μL、TaKaRa LA Taq酶0.2μL，加无菌双蒸水补至25μL。

降落PCR程序：退火温度从65℃降到55℃，每循环下降1℃，一共15个循环；接着进行常规程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min；循环次数为30次，最后72℃延伸10min。

取PCR产物5μL，配制1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

2.1.2PCR产物的回收

目的条带割胶回收，参照Omega D2500-01Gel Extraction Kit试剂盒使用说明操作，具体步骤如下：

①用干净的刀片将条带割下，放到预先称重的1.5mL离心管中，称量胶的重量，按照1g：

1mL的比例加入Binding Buffer（XP2），混合后置于55℃的水浴锅中7min直至胶完全融化，再摇匀2min。

②将HiBind DNA column置于2mL的收集管中。

③吸取①中液体700μL到HiBind DNA column（试剂盒提供）中，室温下10，000×g离心1min。

④倒掉过滤液后将吸附柱放回收集管中。

⑤吸取300μL Binding Buffer（XP2）到HiBind DNA column中，室温下10，000×g离心1min以清洗吸附柱，倒掉滤液，再次使用收集管。

⑥吸取700μL用无水乙醇稀释后的SPW Wash Buffer到HiBind DNA column中，室温下室温下10，000×g离心1min。

⑦倒掉滤液，将空的吸附柱以最大速度（≥13,000×g）离心2min，使吸附柱基质变干。

⑧将HiBind DNA column放在一个干净的1.5mL离心管中，加30μL预热的Elution Buffer（10mM Tris-HCl，pH8.5），室温放置1min，再以最大速度离心1min，将DNA洗脱出来。

⑨将洗脱液吸回吸附柱里，同样条件再洗脱一次，以提高DNA的回收率。

2.1.3PCR产物的纯化

纯化回收的PCR产物使用Roche公司的High Pure PCR Product Purification Kit，步骤如下：

①加100μL Binding Buffer到30μL的PCR回收产物中，混合均匀。

②将过滤管和收集管组合在一起，把样品吸到上池。

③8,000×g离心30s。

④取出过滤管，倒掉过滤液，将过滤管放回收集管。

⑤加500μL Wash Buffer到过滤管的上池。

⑥8,000×g离心30s。

⑦取出过滤管，倒掉过滤液，将过滤管放回收集管。

⑧加200μL Wash Buffer到过滤管的上池。

⑨最高速度（13,000×g）离心2min。

⑩取出过滤管，扔掉收集管及过滤液。

将过滤管放到新的1.5mL离心管中，加50μL Elution Buffer，8,000×g离心30s，DNA被洗脱下来。

将洗脱液吸回到过滤管，8,000×g离心30s，再洗脱一次以提高回收率。

微量核酸检测仪检测浓度。

2.2结果

降落PCR产物为一条1500bp左右的条带，如图3。

实施例3PCR产物克隆和测序

3.1方法

3.1.1PCR产物的连接

将回收、纯化后的目的片段与载体连接，根据TaKaRa的pMD-18T Vector试剂盒说明书操作，连接体系如下：pMD-18T Vector0.5μL，PCR纯化产物5μL，SolutionⅠ4.5μL。操作在冰上进行，离心混匀，16℃水浴锅中连接3h以上。

3.1.2连接产物的转化

①将连接产物加到预置在冰上的感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min。

②42℃水浴锅中热激90s后立即移到冰浴中，放置3min。

③加入800μL LB液体培养基，37℃，220rpm/min摇床中培养40min。

④将菌液室温下3,000rpm/min离心10min，倒掉上清液。

⑤用灭菌枪头将沉淀的菌体打散混匀并吸到加有氨苄（Amp）的LB固体培养基平板中涂布均匀。

⑥将平板放在37℃培养箱中倒置培养过夜。

3.1.3阳性单克隆菌落的挑选与测序

在培养过夜的平板中随机挑选菌落，接种于加氨苄的液体LB培养基中培养至中等浓度。以菌液为模版，用相同引物再进行降落PCR扩增，扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定为所克隆基因后，取100μL菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

3.2结果

测序后得到一条长1536bp的序列，该序列为一个完整的开放阅读框（Open readingframe），共编码511个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。

红色红曲霉谷氨酸脱羧酶基因编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

红色红曲霉谷氨酸脱羧酶基因编码区核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例4序列同源性分析

将上述氨基酸序列进行blast比对，结果显示该氨基酸序列有谷氨酸脱羧酶保守区，与烟曲霉（Aspergillus fumigatus）的谷氨酸脱羧酶氨基酸序列同源性最高，为84%。与新萨托菌（Neosartorya fischeri）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、土曲霉（Aspergillusterreus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、白曲霉（Aspergillus kawachii）和构巢曲霉（Aspergillus nidulans）的相似性都达到80%以上。应用MEGA软件将该序列与其他34种物种的GAD氨基酸序列构建系统进化树，结果如图4所示。

序列表

<110>浙江师范大学

<120>红色红曲霉GAD基因的cDNA核苷酸及其合成方法和对应的蛋白质

<160>4

<210> 1

<211>1536

<212> cDNA

<213> 红色红曲霉

<400> 1

   1 ATGGTTCATC TTGCTAGAGT TAACAGCGCC ATCGAGTCCC TGCATCGACG CGTCAATTCC    61 ATCAAACTCG AAAAGGAAGA CGACGATGGC TTCTACTCCA GCGTCTACGG CACCCGCTAC   121 GCCGCTGAAG CTCTCCCTGC GAACGAAATG CCCGAGAAGG AAATGCCACG CGAGGTCGCA   181 TACCGTATGA TTAAAGACGA ACTTAGTCTG GACGGCAATC CCATGCTCAA CTCGGCGAGC   241 TTTGTCACAA CCTACATGGA AGATGAAGCC GAGAAGCTCA TGACCGAATC CTTCAGCAAG   301 AACTTCATCG ACTATGAGGA GTATCCCCAG AGTGCTGAGA TCCAAAATCG CTGTGTCAGC   361 ATGATCGCCA ATCTCTTCCA TGCTCCCCAG GGAGAAGATG CTTCTGAGCA TTCCATGGGT   421 ACTTCCACCA TCGGCTCCTC CGAGGCTATC ATGCTGGGTA CCCTGGCCAT GAAGCGTCGC   481 TGGCAGAACA AGCGTAAGGC CGAGGGCAAG GACTACTCCA GACCCAACCT CGTCGTGAAC   541 AGCGCCGTCC AGGTTTGCTG GGAGAAGGCT GCTCGCTACT TCGATGTTGA GGAGCGCTAC   601 GTCTATTGCA CTGAGTCGCG TTATGTCATT GACCCGGTGG CTGCCGTTGA CCTGGTTGAC   661 GAGAACACCA TCGGTATCTG CGCCATCCTT GGTACCACCT ACACCGGCCA GTACGAGGAT   721 GTCAAGGCGA TCAATGACCT CCTGGTCGAG AGAGGACTTG ATGTTCCTAT CCATGTCGAT   781 GCAGCCAGCG GTGGTTTTGT CGTTCCCTTT GTCAACCCCA AGCTGGAATG GGACTTCCGA   841 CTGGAAAAGG TGGTGTCCAT CAATGTATCC GGACACAAAT ACGGATTGGT ATATCCTGGT   901 GTCGGTTGGG TCGTCTGGAG ATCTCCCGAA TACCTCCCCA AGGACCTGGT CTTCAACATC   961 AACTACCTAG GCGCCGAACA AGCCAGCTTT ACCCTCAACT TCTCCAAGGG CGCCTCCCAG  1021 GTCATCGGCC AGTACTACCA GATGATCCGG TTAGGAAAAC GCGGCTACCG GGCCATCATG  1081 GTCAACCTCA CCCGCATCGC CGACTACCTG TCCCAGGAAC TGGAGAAACT GGGCTTCATC  1141 ATCATGAGCG AAGGTCGCGG CCACGGCTTG CCTCTCGTGG CCTTCCGACT CTCACCAGAC  1201 CGAGACACGC TCTTCGACGA ATTCGCTCTG GCCCACCAAC TCCGCGAACG CGGCTGGGTG  1261 GTCCCTGCCT ACACGATGGC ACCGCACAGC AACTCCCTCA AACTAATGCG GGTGGTGGTC  1321 CGGGAGGACT TCAGCATGAA CCGCTGCGAC AGTCTCATCA CCGACATCAA GCTGGCGTTG  1381 AAGACCTTGG GCGACATGGA CAAGACATTG ATGGAGAAAT ATAAAAGTCA TGTCCGGAGC  1441 CACAGTAACT CAGCCAAGGG GGCTATGCAC CCGCATTACC GGAACGAGAC GCATTCGCTG  1501 CAGGGGAAGA CAGGTAAGAC TCATGGAGTT TGCTAA   

<210>2

<211>511

<212> 氨基酸序列

<213> 红色红曲霉

<400> 2

  1 MVHLARVNSA IESLHRRVNS IKLEKEDDDG FYSSVYGTRY AAEALPANEM PEKEMPREVA

 61 YRMIKDELSL DGNPMLNSAS FVTTYMEDEA EKLMTESFSK NFIDYEEYPQ SAEIQNRCVS

121 MIANLFHAPQ GEDASEHSMG TSTIGSSEAI MLGTLAMKRR WQNKRKAEGK DYSRPNLVVN

181 SAVQVCWEKA ARYFDVEERY VYCTESRYVI DPVAAVDLVD ENTIGICAIL GTTYTGQYED

241 VKAINDLLVE RGLDVPIHVD AASGGFVVPF VNPKLEWDFR LEKVVSINVS GHKYGLVYPG

301 VGWVVWRSPE YLPKDLVFNI NYLGAEQASF TLNFSKGASQ VIGQYYQMIR LGKRGYRAIM

361 VNLTRIADYL SQELEKLGFI IMSEGRGHGL PLVAFRLSPD RDTLFDEFAL AHQLRERGWV

421 VPAYTMAPHS NSLKLMRVVV REDFSMNRCD SLITDIKLAL KTLGDMDKTL MEKYKSHVRS

481 HSNSAKGAMH PHYRNETHSL QGKTGKTHGV C  

<210>3

<211>29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ATGGTYCAYC TYGCYMVRGT BMASMSCGC 29

<210>4

<211>24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

YTARCAAACN CCRTGVGTCT TRCC 24