（一）技术领域

本发明涉及一株新型高效4-氟肉桂酸降解菌——红球菌（Rhodococcu s sp.）HZF1，及其在微生物降解4-氟肉桂酸中的应用。

（二）背景技术

4-氟肉桂酸(4-Fluorocinnamic acid) ，也称对氟肉桂酸，是一种 含氟芳香族化合物，主要由氟肉桂醛、丙二酸和吡啶配制，目前广泛 用于医药中间体、感光剂等领域。4-氟肉桂酸的分子式为 C₉H₇FO₂， 结构式如式（Ⅰ）所示。

含氟有机化合物广泛应用于工业、农业, 并代表着一类非常重要的环 境污染物。含氟有机化合物因为其剂量少、毒性小、性能好而用于农 业，因为其生物稳定性、高生物活性、亲油性而用于生产药物。最近 ，含氟有机化合物被广泛应用于电子工业，例如4-氟苯酚的聚合物和 4-氟肉桂酸聚合物，它们稳定性高、粘度低，在热、光、强电流、化 学品中能保持高的电压。氟代有机物比氯代及溴代有机物受到较少的 关注是因为它们普遍被认为是生物惰性的，人们误认为它们对人类健 康和环境的影响较小。然而,惰性分子更具持久性和更易累积, 被它 们污染的环境也就更不易修复。研究表明, 一些氟代有机物能够在适 合的环境条件下进行有限的生物转 化, 而且, 含氟有机化合物表现出某些显著的生物效果, 如抑制酶 活性,阻碍细胞间物质传递, 膜运输以及影响产能过程等。因此,含氟 有机化合物的生态迁移和转化正日益受到关注。

4-氟肉桂酸的大量使用和生物惰性，使得其在环境中不断累积，对人 体健康和环境安全造成极大危害, 主要表现为抑制酶活性、影响能量 传递、破坏细胞膜间物质传递等而诱发癌症、心肺损害、肝肿大等疾 病。

对含4-氟肉桂酸的污水的处理对保护环境质量很重要。在所有的处理 方法中，利用微生物代谢方法去除4-氟肉桂酸，成本低，有害副产品 少，它能把污染物完全矿化，因此有着广阔的应用前景。

微生物是一类种类多、繁殖快、适应性强、代谢能力强的生物体。若 能筛选分离出能高效降解4-氟肉桂酸的微生物，将4-氟肉桂酸降解成 二氧化碳、水等对人体和环境无毒害的物质，这对维护人类健康有着 深远的意义。

（三）发明内容

本发明目的是提供一株新型高效红球菌属4-氟肉桂酸降解菌HZF1及其 应用。

本发明采用的技术方案是：

红球菌（Rhodococcus sp.）HZF1，保藏于中国典型培养物保藏中心 ，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期为2012年10 月15日，保藏编号为CCTCC No: M 2012404。

所述红球菌HZF1的16S rDNA的Genbank登陆号为JX878615。

红球菌HZF1（Rhodococcus sp. HZF1）菌株的筛选与鉴定：

1）培养基

无机盐培养基终浓度组成为：每升培养液中含有NaCl 1g，K₂HPO₄  1.5g，KH₂PO₄ 0.5g，（NH4）₂SO₄ 1.5g，MgSO₄ 0.1g，1ml微量元 素溶液，溶剂为水，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制 得，其中每升微量元素溶液中含MnSO₄﹒H₂O 0.13_g，ZnCl₂ 0.23g， CuSO₄﹒H₂O 0.03g，CoCl₂﹒6H₂O 0.42g，Na₂MoO₄﹒2H₂O 0.15g， AlCl₃﹒6H₂O 0.05g，溶剂为水。

富集培养液：在无机盐培养基中加入4-氟肉桂酸，使得4-氟肉桂酸的 终浓度为500mg/L。

LB液体培养基：每升培养液中含有酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠1 0.0g，溶剂为水，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得 。

LB固体培养基：每升培养中含有酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10. 0g，琼脂15.0g，溶剂为水，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20mi n）后制得。

2）菌株分离纯化

污泥样品采自杭州农药厂，取5ml污泥样品置于250ml锥形瓶中，加入 100ml富集培养液，黑暗振荡培养（30℃，150rpm）1周，取5ml上层浊 液于新鲜的富集培养液100 ml中，继续黑暗振荡培养（30℃，150rp m）1周，重复上述操作过程3次，每次培养的接种物均取自于上次培养 所得的培养液。

取最后一次培养所得的培养液5 ml进行梯度稀释（10^-4、10^-5、10^-6） ，取各个稀释后的培养液150μl涂布于含500mg/L4-氟肉桂酸的LB固体 培养基平板上，置于恒温培养箱（30℃）中培养，待平板上长出菌落 后，挑取各菌落于含500mg/L4-氟肉桂酸的LB固体培养基平板上反复纯 化，直至菌落单一，将纯化后的各菌落分别接至LB液体培养基试管中 振荡培养（30℃，150rpm）过夜，将培养好的菌液离心（8000rpm，5 min）后接至 富集培养液中25~ 45℃培养3d，通过高效液相色谱法（HPLC）检测各 富集培养液中4-氟肉桂酸的残留量，最后筛选获得一株能高效降解4- 氟肉桂酸的菌株，命名为HZF1。

3）菌株鉴定

将上述获得的菌株进行形态特征和分子生物学鉴定，该菌株的电镜照 片如图1所示。该菌株的主要生物学特征为：革兰氏染色反应阳性，需 氧型，无芽孢，大小约为 (1.7~ 3.2 μm），菌落平坦，中间凸起 ，边缘扩散，呈浅橙色，接触酶阴性，氧化酶阴性，甲基红试验阳性 ，能利用β-环糊精、淀粉、葡萄糖、吐温40、乙酸盐，乙酰甲基甲醇 试验阴性，V.P.反应阳性。该菌株最适宜的生长条件为pH值7.0，温度 30℃。该菌株经16S rDNA序列分析鉴定为Rhodococcus属，因此命名 为红球菌（Rhodococcus sp.）HZF1。

本发明还涉及所述的红球菌HZF1在微生物降解4-氟肉桂酸中的应用。

具体的，所述降解在25~ 45℃、pH5.0 ~ 9.0、黑暗条件下进行， 一般需振荡（100~200 rpm）。

所述降解在30℃、pH 7.0、150rpm、黑暗条件下进行。

在4-氟肉桂酸终浓度为100~1500 mg/L（优选 200 mg/L）的无机盐 培养基，加入含红球菌HZF1的细胞悬液，在25~ 45℃、pH值为5.0~  9.0的条件黑暗振荡培养16~24h，可使反应液中4-氟肉桂酸的质量残留 量小于4%；所述含红球菌HZF1的细胞悬液加入量使反应体系中红球菌 HZF1终浓度为1~5×10⁷个/ml。

实际应用中，所述菌株通常需要经过活化和扩大培养，具体过程如下 ：

（1）斜面培养：将红球菌HZF1接种于斜面培养基，25~ 45℃培养 5~7天，获得菌体斜面；所述斜面培养基的终浓度组成为：酵母粉10g /L，蛋白胨5.0g/L，氯化钠10.0g/L，琼脂20.0g/L，溶剂为水；

（2）种子培养：从步骤（1）菌体斜面上挑取一接种环菌体接种至无 机盐培养基中，25~ 45℃培养5~7天，获得种子液；所述无机盐培养 基终浓度组成为：每升培养液中含有NaCl 1g，K₂HPO₄ 1.5g，KH₂P O₄ 0.5g，（NH4）₂SO₄ 1.5g，MgSO₄ 0.1g，1ml微量元素溶液，溶 剂为水，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得，其中每 升微量元素溶液中含MnSO₄﹒H₂O 0.13_g，ZnCl₂ 0.23g，CuSO₄﹒H₂O 0.03g，CoCl₂﹒6H₂O 0.42g，Na₂MoO₄﹒2H₂O 0.15g，AlCl₃﹒6 H₂O 0.05g，溶剂为水；

（3）扩大培养：将步骤（2）获得的种子液以体积浓度10~20%的接种 量接种至LB液体培养基中，30℃、150rpm振荡养至对数生长期，获得 菌液，将菌液离心，弃上清，沉淀用pH值为7.0的磷酸缓冲液悬浮，获 得含红球菌HZF1的细胞悬液，该细胞悬液可投加于水体或土壤中用于 4-氟肉桂酸的降解；所述LB液体培养基终浓度组成为：每升培养中含 有酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，溶剂为水，自然pH值。

本发明菌体生长量采用紫外分光光度计来检测，通过测量菌体（即含 菌细胞培养液）在600nm处的吸光度值来表示。

本发明采用反相高效液相色谱法检测无机盐培养基中4-氟肉桂酸的残 留量。反相高效液相色谱检测条件：流动相为甲醇：10 mM乙酸、乙 酸铵缓冲溶液=50:50（体积比），分析柱为Grace Alltima C18色谱 柱 (4.6×250mm，5μm)，流速为0.8ml/min，进样量为10μl，柱温 为30℃。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

本发明所述红球菌HZF1可通过直接投加的方式应用于水体和土壤中4- 氟肉桂酸的降解，能安全、高效、快速的降解水体、土壤等物体上残 留的4-氟肉桂酸，含有该菌株的菌剂制备工艺简单，成本低廉，使用 方便，具有很好的应用前景。

（四）附图说明

图1 为本发明红球菌HZF1的电镜图；

图2为4-氟肉桂酸的标准曲线图；

图3 为本发明的红球菌HZF1在不同温度下对4-氟肉桂酸的降解曲线图 ：正方形（）为30℃，圆形（）为25℃，正三角形（）为37℃，倒 三角形（）为45℃；

图4为本发明的红球菌HZF1在不同pH下对4-氟肉桂酸降解影响图；

图5为本发明的红球菌HZF1在纯培养条件下对终浓度为200mg/L的4-氟 肉桂酸的降解曲线图；

图6为本发明的红球菌HZF1在4-氟肉桂酸终浓度为200mg/L纯培养条件 下的生长曲线图；

图7为本发明的红球菌HZF1对不同浓度4-氟肉桂酸的降解曲线图。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

实施例1：菌株的筛选与鉴定

1）培养基

无机盐培养基的配制：NaCl 1g，K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 0.5g，（ NH₄）₂SO₄ 1.5g，MgSO₄ 0.1g，1ml微量元素溶液，蒸馏水补足至1 000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min） 后制得，其中每升微量元素溶液中含MnSO₄﹒H₂O 0.13_g，ZnCl₂ 0. 23g，CuSO₄﹒H₂O 0.03g，CoCl₂﹒6H₂O 0.42g，Na₂MoO₄﹒2H₂O 0 .15g，AlCl₃﹒6H₂O 0.05g，用蒸馏水补足至1000ml。

富集培养液：在无机盐培养基中加入4-氟肉桂酸，使得4-氟肉桂酸的 终浓度为500mg/L。

LB液体培养基的配制：酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏 水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃ ，20min）后制得。

LB固体培养基的配制：酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，琼脂 15.0g，蒸馏水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽 灭菌（121℃，20min）后制得。

2）菌株分离纯化

污泥样品采自杭州农药厂，取5ml污泥样品置于250ml锥形瓶中，加入 100ml富集培养液，黑暗振荡培养（30℃，150rpm）1周，取5ml上层浊 液于新鲜的富集培养液中，继续黑暗振荡培养（30℃，150rpm）1周， 重复上述操作过程3次，每次培养的接种物均取自于上次培养所得的培 养液。

取最后一次培养所得的培养液5ml进行梯度稀释（10^-4、10^-5、10^-6）， 取各个稀释后的培养液150μl涂布于含500mg/L4-氟肉桂酸的LB固体培 养基平板上，置于恒温培养箱（30℃）中培养，待平板上长出菌落后 ，挑取各菌落于含500mg/L4-氟肉桂酸的LB固体培养基平板上反复纯化 ，直至菌落单一，将纯化后的各菌落分别接至LB液体培养基试管中振 荡培养（30℃，150rpm）过夜，将培养好的菌液离心后接至富集培养 液中培养3d，通过反相高效液相色谱法检测各富集培养液中4-氟肉桂 酸的残留量，最后筛选获得一株能高效降解4-氟肉桂酸的菌株，命名 为HZF1。

3）菌株鉴定

将上述获得的菌株进行形态特征和分子生物学鉴定，该菌株的电镜照 片如图1所示。该菌株的主要生物学特征为：菌体球状，无鞭毛，无芽 孢， 大小约为 (1.7~ 3.2 μm)，菌落平坦，中间凸起，边缘扩散，呈 浅橙色，接触酶阴性，氧化酶阴性，甲基红试验阳性，能利用β-环糊 精、淀粉、葡萄糖、吐温40、乙酸盐，乙酰甲基甲醇试验阴性，V.P. 反应阳性。该菌株最适宜的生长条件为pH值7.0，温度30℃。该菌株经 16S rDNA序列分析鉴定为Rhodococcus属，因此命名为红球菌（Rhod ococcus sp.）HZF1（CCTCC No: M 2012404）。

实施例2：含菌细胞悬液的制备

（1）斜面培养：将红球菌HZF1接种于斜面培养基，30℃培养6天，获 得菌体斜面；所述斜面培养基的终浓度组成为：酵母粉10g，蛋白胨5 .0g，氯化钠10.0g，琼脂20.0g，水1000ml；

（2）种子培养：从步骤（1）菌体斜面上挑取一接种环菌体接种至无 机盐培养基中，30℃培养6天，获得种子液；所述无机盐培养基终浓度 组成同实施例1；

（3）扩大培养：将步骤（2）获得的种子液以体积浓度10~20%的接种 量接种至LB液体培养基（100 mL）中，30℃、150rpm振荡培养至对数 生长期，获得菌液，将菌液离心（8000rpm，5min），弃上清，沉淀用 pH值为7.0的磷酸缓冲液悬浮，获得含红球菌HZF1细胞悬液100 mL， 其中细胞悬液中的红球菌HZF1浓度为5×10⁸个/ml；

所述LB液体培养基终浓度组成同实施例1；

pH为7.0的0.2 mol/L的磷酸缓冲液的配方为：取0.2 mol/L的磷酸二 氢钠39ml和0.2mol/L的磷酸氢二钠61ml，用超纯水定容至1000ml，高 压蒸汽灭菌（121℃、20min）后即得。

实施例3：4-氟肉桂酸降解实验

1）无机盐培养基中菌体浓度与4-氟肉桂酸含量的检测：

菌体生长量采用紫外分光光度计来检测，通过测量培养液中菌体在60 0nm处的吸光度值来表示。

本实验采用反相高效液相色谱法检测无机盐培养基中4-氟肉桂酸的残 留量。反相高效液相色谱检测条件：流动相为甲醇：10 mM乙酸、乙 酸铵缓冲溶液=50:50（体积比），分析柱为Grace Alltima C18色谱 柱 (4.6×250mm，5μm)，流速为0.8ml/min，进样量为10μl，柱温 为30℃。

2）4-氟肉桂酸降解实验：

将4-氟肉桂酸标准品用无菌水溶解配制成100 mg/L的标准液，在反相 液相色谱测试标准曲线，4-氟肉桂酸标准曲线如图2所示，标准曲线方 程为y=4.541x+11.737，R²=0.9951，y为峰面积，x为4-氟肉桂酸浓度 。

a、不同温度对降解的影响：取4个250ml锥形瓶，分别加入100ml无机 盐培养基，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后加入4-氟肉桂酸，使4- 氟肉桂酸终浓度均为200 mg/L，各取实施例2方法获得的含菌细胞悬 液5ml（5×10⁸个/ml），分别接种于此无机盐培养基中，使红球菌HZ F1终浓度约为2.5×10⁷个/ml，分别于25、30、37、45 ℃培养摇床（ pH 7.0，150rpm），每小时定时取样测定残留4-氟肉桂酸浓度，结果 如图 3所示，显示30℃为最适降解温度。

b、不同pH对降解的影响：取5个250ml锥形瓶，分别加入100ml无机盐 培养基，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后加入4-氟肉桂酸，使4-氟 肉桂酸终浓度均为200 mg/L，各取实施例2方法获得的含菌细胞悬液 5ml，分别接种于此无机盐培养基中，使红球菌HZF1终浓度约为2.5× 10⁷个/ml，分别调节pH 至5.0、6.0、7.0 、8.0和 9.0，在30℃、 150rpm下摇床培养，每小时定时取样测定残留4-氟肉桂酸浓度，结果 如图4所示，显示pH7.0为最适降解pH。

c、不同时间对降解的影响：取250ml锥形瓶，加入100ml无机盐培养基 ，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后加入4-氟肉桂酸，使4-氟肉桂酸 终浓度为200 mg/L，共设置3个平行样。各取实施例2方法获得的含菌 细胞悬液5ml，分别接种于此无机盐培养基中，使红球菌HZF1终浓度约 为2.5×10⁷个/ml，相应的设置3个不含该菌种的平行实验作为空白对 照，然后一同置于摇床（30℃，pH7.0，150rpm）中黑暗振荡培养。在 培养时间为0、3、6、9、12、24、36、48、60、72h时定时取样，根据 上述检测方法来检测无机盐培养基中菌体的生长量与4-氟肉桂酸的残 留量，结果见图5所示。

本发明菌株对200 mg/L浓度的4-氟肉桂酸的降解曲线如图5所示，菌 体的生长曲线如图6所示，图6可以看出OD₆₀₀从0.18增加到0.42，说明菌 体生长良好，观察图5，可以发现，培养24h后，本发明的4-氟肉桂酸 降解菌对200 mg/L的4-氟肉桂酸的降解率接近为100%，所有未加菌的 空白对照在24h后的水解率均小于5%。

d、对不同浓度4-氟肉桂酸降解的影响：

取4个250ml锥形瓶，分别加入100ml无机盐培养基，高压蒸汽灭菌（1 21℃，20min）后加入4-氟肉桂酸，使4-氟肉桂酸终浓度分别为200、 500、1000、1500 mg/L，各取实施例2方法获得的含菌细胞悬液5ml， 分别接种于此无机盐培养基中，使红球菌HZF1终浓度约为2.5×10⁷个 /ml，在pH 7.0 、30℃、150rpm下摇床培养，定时取样测定残留4- 氟肉桂酸浓度，结果如图7所示。

本发明菌株对浓度为200~1500 mg/L的4-氟肉桂酸的降解率如图7所示 ，结果表明都具有非常好的降解能力，而且此菌种为新型4-氟肉桂酸 降解菌，因此，该菌对研究4-氟肉桂酸的降解途径与降解基因具有非 常大的促进作用，对环境中4-氟肉桂酸的降解尤其是对4-氟肉桂酸的 集 中修复具有一定的积极意义。