技术领域

本发明属于食品工业领域，特别涉及一种纤维素酶解和酸水浸泡相结合处 理后回流提取总猴头菌素的高效复合提取方法。

背景技术

猴头菌菌丝体粉末中的猴头菌素是一类萜苷类物质，这些化合物显示出对 神经生长因子(NGF)的强有力的刺激性合成作用，活性远远大于肾上腺素。可刺 激NGF合成的猴头菌素已经有望成为神经元的退行性疾病如阿尔茨海默病和外 周神经再生的药物。

猴头菌素通常为白色晶体，为亲脂性成分，易溶于亲脂性有机溶剂，可溶 于醇，难溶于水。

猴头菌素都有一个cyathane骨架(如式I所示),是有一定角度的5-6-7三个 圆环组成，被称作鸟巢烷基二萜，另外加上一个木糖苷结构组成了具有活性的 猴头菌素,并且木糖苷在猴头菌素的生物活性方面起着很重要的作用。

目前，国内对猴头菌素提取的研究较少，尚处于起步阶段。猴头菌素的常 规提取方法主要有浸渍法、回流法、微波辅助萃取、超声波提取法、超临界流 体萃取法等方法。传统的方法溶剂消耗量大，操作复杂，提取效率很低。提取 技术的复合使提取效率有所提高，且保持了猴头菌素的品质和活性，对于猴头 菌素的综合利用具有很重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的问题是传统溶剂提取法提取效率低的问题，采用一种纤 维素酶解和酸水浸泡相结合处理后回流提取总猴头菌素的高效复合提取方法， 并采用野黄芩苷为定量标准品，提高提取效率，有效降低成本。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种猴头菌菌丝体中总猴头菌素的高效提取方法，所述方法为

猴头菌菌丝体烘干后粉碎过60目筛，得猴头菌菌丝体粉末；

猴头菌菌丝体粉末中加入水，所述水的体积用量以猴头菌菌丝体粉末的质 量计为10mL/g，用盐酸调节pH值至4.5，加入纤维素酶，置于50℃下恒温水浴 酶解90min，所述纤维素酶的质量用量为猴头菌菌丝体粉末质量1/100，酶解结 束后煮沸10～30分钟使纤维素酶失活；所得酶解液中加盐酸调节pH值至2，浸 泡24h，蒸除溶剂，剩余固体加入提取溶剂，超声混合后，加热回流提取，所述 提取溶剂为体积分数60～95％的乙醇，提取时间10～60min、所述提取溶剂的体 积用量以猴头菌菌丝体粉末的质量计为5～20mL/g；所得提取液过滤两次，所得 滤液A挥干成浸膏，用水溶解，加活性炭脱色后过滤，所得滤液B用乙酸乙酯 萃取，取乙酸乙酯层减压浓缩、浓缩液冷却后静置结晶，结晶体干燥，即制得 猴头菌菌丝体总猴头菌素提取物。

所述提取溶剂优选体积分数95％的乙醇。

所述提取溶剂的体积用量以猴头菌菌丝体粉末的质量优选计为10mL/g。

所述提取时间优选20～40min。

本发明的有益效果是：

采用纤维素酶解和酸水浸提结合处理的回流提取方法，具有消耗溶剂少、 提取效率高等优点。本发明优化了提取工艺，使提取得到的猴头菌菌丝体总猴 头菌素提取物中总猴头菌素的提取率显著提高，提取得到的总猴头菌素相对于 原料猴头菌菌丝体的质量分数为可达3.7％以上。

附图说明

图1为本发明猴头菌菌丝体中总猴头菌素的提取工艺流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限 于此：

本发明采用野黄芩苷为定量标准品，制作标准曲线和回归方程按以下步骤 进行：准确称取野黄芩苷0.2g溶于无水乙醇得到0.8mg/mL标准溶液，分别移 取0.4,0.8,1.2,1.6,2.0mL标准溶液定容到到50mL容量瓶中，配制得到浓度分别 为6.4μg/mL、12.8μg/mL、19.2μg/mL、32μg/mL的标准品溶液，分别在210nm 处测定紫外吸光值，以标准品溶液的浓度为横坐标，紫外吸光值为纵坐标，制 作标准曲线，绘制回归方程。

比较例1回流提取

猴头菌菌丝体烘干后粉碎过筛，得60目的猴头菌菌丝体粉末。取200g 猴头菌菌丝体粉末，转移到圆底烧瓶中，再往圆底烧瓶中加入2L95v％的工业酒 精，超声10分钟，使猴头菌菌丝体粉末与溶剂充分混合。然后加热回流提取， 提取时间40min，所得提取液A过滤两次，将获得的滤液用95v％工业酒精定容 到2L，所得提取液B用旋转仪蒸干成浸膏，然后用纯净水溶解，加活性炭脱色 后过滤，用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取液、薄层色谱鉴定，显色剂为香草 醛硫酸乙醇溶液，定性确实存在萜类物质。取乙酸乙酯层减压浓缩、干燥，制 得所述猴头菌菌丝体总猴头菌素提取物15.3g，其中含总猴头菌素4.976g。总猴 头菌素的含量按以下方法测定：提取液B中取2mL定容到250mL容量瓶中， 所得样液进行紫外全扫描，其出现的最大吸收峰出现在210nm处，用紫外分光 光度仪在210nm下测吸光度，根据标准品得到的回归方程计算得到样液中总猴 头菌素的浓度，然后换算得到提取液B中总猴头菌素的浓度，进一步计算得到 提取得到的总猴头菌素的质量为4.976g，提取得到的总猴头菌素相对于原料猴 头菌菌丝体的质量分数为2.488％。

比较例2纤维素酶解+回流提取

猴头菌菌丝体烘干后粉碎过筛，得60目的猴头菌菌丝体粉末。取200g猴 头菌菌丝体粉末，加入2L水，用盐酸调节PH值至4.5，加入2g纤维素酶，密 封置于50℃下恒温水浴酶解90min，然后取出煮沸10分钟灭酶活。转移到圆底 烧瓶中，旋转蒸发完水分，再往圆底烧瓶中加入2L95v％的工业酒精，超声10 分钟，使猴头菌菌丝体粉末与溶剂充分混合。回流提取，提取时间40min，所得 提取液A过滤两次，将获得的滤液用95％工业酒精定容到2L，得提取液B，取 2mL按照实施例1的方法检测总猴头菌素的含量，计算得到提取得到的总猴头 菌素的质量为5.876g，提取得到的总猴头菌素相对于原料猴头菌菌丝体的质量 分数为2.938％。将提取液B用旋转仪蒸干成浸膏，然后用纯净水溶解，活性炭 脱色后过滤，用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取液薄层色谱鉴定，显色剂为香 草醛硫酸乙醇溶液，定性确实存在萜类物质。取乙酸乙酯层减压浓缩、干燥， 制得所述猴头菌菌丝体总猴头菌素提取物16.0g，其中含总猴头菌素5.876g。

比较例3酸水浸泡+回流提取

猴头菌菌丝体烘干后粉碎过筛，得60目的猴头菌菌丝体粉末。取200g猴 头菌菌丝体粉末加入2L水，用盐酸调节PH值至2，密封静置24h。转移到圆底 烧瓶中，旋转蒸发完水分，再往圆底烧瓶中加入2L95v％的工业酒精，超声10 分钟，使猴头菌菌丝体粉末与溶剂充分混合。回流提取，提取时间40min，所得 提取液A过滤两次，将获得的滤液用95％工业酒精定容到2L，得提取液B，取 2mL按照实施例1的方法检测总猴头菌素的含量，计算得到提取得到的总猴头 菌素的质量为6.87g，提取得到的总猴头菌素相对于原料猴头菌菌丝体的质量分 数为3.435％。将提取液B用旋转仪蒸干成浸膏，然后用纯净水溶解，活性炭脱 色后过滤，用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取液薄层色谱鉴定，显色剂为香草 醛硫酸乙醇溶液，定性确实存在萜类物质。取乙酸乙酯层减压浓缩、干燥，制 得所述猴头菌菌丝体总猴头菌素提取物15.7g，其中含总猴头菌素6.87g。

实施例1

猴头菌菌丝体烘干后粉碎过筛，得60目的猴头菌菌丝体粉末。取200g猴 头菌菌丝体粉末加入2L水，用盐酸调节PH值至4.5，加入2g纤维素酶，密封 置于50℃下恒温水浴酶解90min，然后取出煮沸10分钟灭酶活。用盐酸调节PH 值至2，密封静置24h。转移到圆底烧瓶中，旋转蒸发完水分，再往圆底烧瓶中 加入2L95v％的工业酒精，超声10分钟，使猴头菌菌丝体粉末与溶剂充分混合。 回流提取，提取时间40min，所得提取液A过滤两次，将获得的滤液用95v％工 业酒精定容到2L，得提取液B，取2mL按照实施例1的方法检测总猴头菌素的 含量，计算得到提取得到的总猴头菌素的质量为8.39g，提取得到的总猴头菌素 相对于原料猴头菌菌丝体的质量分数为4.195％。将提取液B用旋转仪蒸干成浸 膏，然后用纯净水溶解，活性炭脱色后过滤，用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃 取液薄层色谱鉴定，显色剂为香草醛硫酸乙醇溶液，定性确实存在萜类物质。 取乙酸乙酯层减压浓缩、干燥，制得所述猴头菌菌丝体总猴头菌素提取物14.8g， 其中含总猴头菌素8.39g。

实施例2

猴头菌菌丝体烘干后粉碎过筛，得60目的猴头菌菌丝体粉末。取200g猴 头菌菌丝体粉末加入2L水，用盐酸调节PH值至4.5，加入2g纤维素酶，密封 置于50℃下恒温水浴酶解90min，然后取出煮沸10分钟灭酶活。用盐酸调节PH 值至2，密封静置24h。转移到圆底烧瓶中，旋转蒸发完水分，再往圆底烧瓶中 加入2L95v％的工业酒精，超声10分钟，使猴头菌菌丝体粉末与溶剂充分混合。 回流提取，提取时间20min，所得提取液A过滤两次，将获得的滤液用95v％工 业酒精定容到2L，得提取液B，取2mL按照实施例1的方法检测总猴头菌素的 含量，计算得到提取得到的总猴头菌素的质量为7.522g，提取得到的总猴头菌 素相对于原料猴头菌菌丝体的质量分数为3.761％。将提取获得的酒精溶液用旋 转仪蒸干成浸膏，然后用纯净水溶解，活性炭脱色后过滤，用乙酸乙酯萃取， 取乙酸乙酯萃取液薄层色谱鉴定，显色剂为香草醛硫酸乙醇溶液，定性确实存 在萜类物质。取乙酸乙酯层减压浓缩、干燥，制得所述猴头菌菌丝体总猴头菌 素提取物14.5g，其中含总猴头菌素7.522g。