技术领域

本发明属于生物技术农业、环境保护领域，涉及一株应用复苏可培养化技术分离到的“活的非可培养（VBNC）”节杆菌属菌种（Arthrobactersp.DSC4）以及该菌种的复苏方法和应用。

背景技术

含氨氮污水的生物处理是当今农业、环保行业极为重要的一项技术措施，其中氨态氮的氧化，亚硝态氮的氧化，硝态氮的还原以及脱氮等关键技术环节中需要有多种微生物的参与，降解转化无机与有机态氮素。一般传统可分离的单一功能的亚硝化细菌如Nitrosomonas、Nitrosococcus属中的菌种，硝化菌如Nitrobacter、Nitrococcus属的菌种，反硝化脱氮菌如Micrococcusdenitrificans等为自养细菌，硝化反硝化作用所需时间长、效率低。筛选具备硝化反硝化功能的异养硝化细菌菌种与量化功能是目前研究的热门。

自然界生态环境中的细菌能够经传统分离法获取的仅有0.01-10%，绝大部分处于活的非可培养（VBNC）、类似于休眠状态。就环境微生物资源而言，获取自然界中90-99.99%的资源菌种包括上述氨氮污水处理环节中的自养与异养硝化菌群需要有新思路新方法的创新，才能挖掘、开发、利用这些未知的微生物资源。

VBNC状态细菌的分离与筛选可以利用一些特殊信号分子复苏促进其处于休眠状态细菌的可培养化。（丁林贤,苏晓梅,横田明.活的但非可培养(VBNC)状态菌的研究进展及应用展望.《微生物学报》.2011,51（7）:858-862.）阐述了VBNC状态菌的形成机理、转变与种类、复苏、研究意义及其应用展望。并报道了丁林贤等在十余年间针对生态环境中处于VBNC状态菌的复苏、可培养化、系统进化关系及潜在功能等方面的一些研究成果，拟为微生物资源的开发与应用提供新的科学依据。并公开了复活促进因子(Rpf，resuscitationpromotingfactor)是由藤黄球菌(M.luteus)分泌的一种能使处于VBNC状态的该菌重新恢复其生长繁殖能力的蛋白质，分子量约为16－17kDa。Mukamolova报道了Rpf可以复苏处于VBNC时期的革兰氏阳性菌Mycobacterium属的结核分枝杆菌(M．tuberculosis)、

牛分枝杆菌(M．bovis)、堪萨斯分枝杆菌(M．kansasii)，耻垢分枝杆菌(M．smegmatis)和鸟分枝杆菌(M．avium)等。并且同Rpf相似的基因也在链霉菌、结核菌、棒状杆菌等高GC的革兰氏阳性菌中被发现。另外，Mukamolova等人还报道了Rpf采用自分泌或旁分泌的方式分泌信号，不但能使休眠的微生物复活，还可以刺激正常菌的生长，并能调控细胞的繁殖过程。

目前国内对于在污水处理系统中分离VBNC状态硝化菌群的技术以及复苏可培养化的VBNC状态的硝化细菌尚未见有公开报道。

发明内容

根据VBNC微生物资源的挖掘利用以及针对氨氮污水生物处理亟需高效率硝化反硝化细菌资源的社会需求，本发明目的之一是提供一种复苏可培养化的VBNC节杆菌DSC4菌株，本发明目的之二是提供上述的节杆菌DSC4菌株的活化培养基，本发明目的之三是提供上述的VBNC节杆菌DSC4菌株应用于含硝酸盐基质的反硝化脱氮。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

复苏可培养化的VBNC节杆菌DSC4（Arthrobactersp.DSC4）菌株，该菌株的保藏编号为CCTCCNo：M2011406，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2011年11月21日。分类命名为：节杆菌DSC4Arthrobactersp.DSC4。上述的菌株以污水生物处理系统中的VBNC状态菌群作为分离源，利用复苏可培养化技术取得的VBNC资源细菌。该菌株在活化培养基上（本专利活化培养基配方），30℃培养2d，菌落直径2-3mm，浅灰色或淡黄色，有光泽；细胞无鞭毛、不运动；革兰氏阳性细菌。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种用于上述的节杆菌DSC4菌株的活化培养基，该培养基按重量百分比计有以下的组分构成：

营养肉汤培养基1.0~3.0g；酵母膏0.2~0.5g；

葡萄糖1.5~5.0g；琼脂1.0~4.0%；

含复活促进因子Rpf的复苏培养液2~20%，去离子水1000ml；

上述的百分比为占培养基总量的体积百分比。

作为优选，上述的含复活促进因子Rpf的复苏培养液由培养基基液、细菌液和土壤液构成；所述的细菌液由藤黄微球菌菌种在菌种液体培养基上培养至对数期后期，经离心去除菌种液体培养基提取获得蛋白质，含有复活促进因子Rpf，细菌液按体积比为培养基基液的1-10%；所述的土壤液由经风干、过筛、去除杂质的园土，加自来水，多次灭菌，过滤取滤液或离心取上清液，土壤液按体积比为培养基基液的1-5%。

上述的节杆菌DSC4菌株的活化培养基配制方法，该方法包括以下的步骤：称取营养肉汤培养基1.0~3.0g，酵母膏0.2~0.5g，葡萄糖1.5~5.0g，去离子水1000ml，pH调至7.0，加1.0~4.0琼脂，经110~130℃、10~30min高压灭菌后冷却至室温；另在无菌条件下加入2~20%(v/v)经0.22µm滤膜过滤灭菌、pH7.0的复苏培养液，搅拌混匀，分注干固，倒置4-10℃保藏待用。

作为优选，上述的复苏培养液的制备方法如下：

1）取少量藤黄球菌菌种接种于菌种液体培养基，25~35˚C、100~150rpm振动培养；细菌生长至对数期后期，培养液用3000~8000rpm，10~30min离心抽提去除菌体；经0.20~0.25μm膜过滤灭菌后，-30~-10℃保存备用；

2）取经风干、过筛、去除杂质的园土1kg，加自来水1~2L，110~130℃、10~40min高压灭菌锅灭菌；室温待一晚后，再度用同法灭菌；1500~2500r/min低速离心取上清液或用滤纸过滤弃渣获得滤液，经110~130℃、10~30min高压灭菌锅灭菌后冷却，-30~-10℃保存备用；

3）准确称取培养基基液的各组分，pH调至7.0，110~130℃、10~30min高压灭菌锅灭菌后冷却至室温待用；培养基基液适宜多数细菌的分离，对于有特殊要求以及有选择性的细菌可以相应加减营养组分；

4）使用前，在无菌条件下，培养基基液中加1-10%细菌液，再加1-5%土壤液，混匀后使用。

为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：

上述的复苏可培养化的VBNC节杆菌DSC4菌株应用于含硝酸盐基质的反硝化脱氮。具体的方法是：将所述的复苏可培养化的VBNC节杆菌DSC4菌株经活化培养、前培养后加入污水生物处理系统中。

作为优选，所述的活化培养采用的培养基按重量百分比计由以下的组分构成：

营养肉汤培养基1.0~3.0g；酵母膏0.2~0.5g；

葡萄糖1.5~5.0g；琼脂1.0~4.0%；

含复活促进因子Rpf的复苏培养液10%，去离子水1000ml；

上述的百分比为占培养基总量的体积百分比。

作为优选，所述的前培养采用的培养基按重量百分比计由以下的组分构成：

蛋白胨3.0~8.0g，酵母膏0.2~0.8g，

葡萄糖3.0~8.0g，NaCl1.5~5.5g，

1000ml去离子水，pH调至7.0。

本发明由于采用了以上的技术方案，获得的可培养化VBNC节杆菌DSC4菌株，可使Giltay培养基反应液开始由绿色转为深蓝色并见产气现象，说明该菌种能利用硝酸盐还原形成碱性物质，并产气使指示剂颜色变化。同时测得硝态氮转化率为54.7%，总氮减少率为52.9%，未检测到氨态氮与亚硝态氮的残存，具有明显的反硝化脱氮效果。

附图说明

图1为本发明节杆菌DSC4菌株的菌落图。

图2为本发明节杆菌DSC4菌株的反硝化脱氮效果图。

生物材料保藏说明

复苏可培养化的VBNC节杆菌DSC4（Arthrobactersp.DSC4）菌株，该菌株的保藏编号为CCTCCNo：M2011406，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2011年11月21日。

具体实施方式

本发明实施例所述的培养基制备方法如下：

1、NYGR培养基：称取Nutrientbroth1.6g，Yeastextract0.5g，Glucose2.5g，去离子水1000ml，pH调至7.0，加2%琼脂，经121℃、15min高压灭菌后冷却至室温；另在无菌条件下加入10%(v/v)经0.22µm滤膜过滤灭菌、pH7.0的复苏培养液，搅拌混匀，分注干固；

2、PYGN培养基：Peptone5.0g，Yeastextract0.5g，Glucose5.0g，NaCl2.5g，1000ml去离子水，pH调至7.0；

3、Giltay培养基：A液：KNO₃1.0g，天冬酰胺1.0g，1%BTB酒精溶液5.0mL，蒸馏水500mL；B液：柠檬酸钠8.5g，MgSO₄7H₂O1.0g，FeCl₃6H₂O0.05g，KH₂PO₄1.0g，CaCl₂2H₂O0.2g，蒸馏水500mL。混合A、B两溶液，调节pH值7.0~7.2，经灭菌备用。

4、复苏培养液培养基组成由A、B、与C成分构成（简称：ABC复苏培养基）。

A成分：

细菌液：藤黄球菌MicrococcusluteusIAM14879菌种在LMMD培养基上培养至对数期后期，经离心培养基提取获得蛋白质，含有复活促进因子Rpf，用量为C成分体积的5%。

B成分：

土壤液：取经风干、过筛、去除石块草根等杂质的园土1kg，加自来水1L，121℃、30min高压灭菌锅灭菌；室温待一晚后，再度灭菌、重复三次；2000r/min低速离心取上清液（或用滤纸过滤获得滤液），用量为C成分体积的2%。

C成分：

细菌用胰蛋白胨（Difco公司）（Bactopeptone(Difco)）10.0g，

酵母抽提液（Yeastextract(Difco)）5.0g，

麦芽提取物（Maltextract(Difco)）5.0g，

（水解）酪蛋白氨基酸（Casaminoacids(Difco)）5.0g，

牛肉膏（Beefextract(Difco)）2.0g，

甘油（Glycerol）2.0g，

吐温80（Tween80）0.05g，

七水硫酸镁（MgSO₄7H₂O）1.0g，

加去离子水1000mL，pH7.0。

以上培养基为液体培养基成分，如配制固体培养基时，需加琼脂15-20g，经121℃，15min高压灭菌后冷却使用。

A成分中LMMD培养基组成：

氯化铵（NH₄Cl）4.0g，

磷酸二氢钾（KH₂PO₄）1.4g，

生物素（Biotin）0.005g，

L-蛋氨酸（L-Methionine）0.02g，

硫胺素（Thiamine）0.04g，

肌苷（Inosine）1.0g，

七水硫酸镁（MgSO₄7H₂O）0.07g，

矿物质溶液（Mineralsolution）1.0ml，

L-乳酸锂（LithiumL-lactate）10.0g，

蒸馏水（Distilledwater）1000ml，pH7.5。

其中，上述的矿物质溶液（Mineralsolution）：

硫酸铜（CuSO₄）0.24g，

氯化锰（MnCl₂）0.50g，

硫酸亚铁（FeSO₄）0.10g，

钼酸钠（Na₂MoO₄）0.025g，

硫酸锌（ZnSO₄）0.05g，

蒸馏水（distilledwater）1000ml。

以上为一般细菌复苏培养使用的配方。根据不同生态环境的要求，C成分可以作相应的调整。

复苏培养基的配制方法：

1.取少量藤黄球菌菌种接种于LMMD液体培养基，30˚C、120rpm振动培养；细菌生长至对数期后期，培养液用5000rpm，20min离心抽提去除菌体；经0.22μm膜过滤灭菌后，-20℃保存备用；

2.取经风干、过筛、去除石块草根等杂质的园土1kg，加自来水1L，121℃、30min高压灭菌锅灭菌；室温待一晚后，再度用同法灭菌；2000r/min低速离心取上清液（或用滤纸过滤弃渣获得滤液），经121℃、15min高压灭菌锅灭菌后冷却，-20℃保存备用；

3.准确称取C成分的各组分，pH调至7.0，121℃、15min高压灭菌锅灭菌后冷却至室温待用。C组分适宜多数细菌的分离，对于有特殊要求以及有选择性的细菌可以相应加减营养组分；

4.使用前，应在无菌条件下，C成分中加5%（A/C）A成分，再加3%（B/C）B成分，混匀后使用。

实施例1

从污水生物处理系统中，利用复苏可培养化技术筛选获得VBNC节杆菌DSC4菌株保藏菌种，可培养化VBNC节杆菌DSC4菌株分离自某污水生物处理系统，系统中存在有90%以上一般传统分离方法难以获得、处于活的非可培养（VBNC）类似于休眠状态的细菌，经利用复苏可培养化技术筛选获得处于VBNC状态的节杆菌DSC4菌株。该菌株的保藏编号为CCTCCNo：M2011406，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2011年11月21日。分类命名为：节杆菌DSC4Arthrobactersp.DSC4，该菌株一般需保存于超低温冷冻（零下80度）。经超低温冷冻保藏的DSC4菌株须经NYGR固体培养基活化培养，即接种在NYGR固体培养基上30℃倒置活化培养2-4d后，可临时保存于4℃冰箱备用。

DSC4菌株在NYGR固体培养基上，30℃倒置活化培养2-7d后，可见直径2-3mm，浅灰色或淡黄色，有光泽菌落（附图1）。

DSC4菌株经染色为革兰氏阳性细菌，光学显微镜下可见细胞无鞭毛、不运动、无孢子形成、无荧光色素、形态为短杆至球形的细胞。

在NutrientBroth培养基上的生长温度为5-40℃，最适温度30℃；耐盐范围3-7%（w/v）；pH范围6-11，最适pH7.5。

实施例2

可培养化VBNC节杆菌DSC4菌株对硝酸盐基质的反硝化脱氮效果的培养鉴定方法，包括以下的步骤：

①取可培养化VBNC节杆菌DSC4菌株保藏菌种，在无菌条件下，挑取少量菌种转接到NYGR培养基上，30℃活化培养2-4d；

②挑取少量经活化培养的菌种①接种到PYGN液体培养基中进行30℃、2d前培养；

③在Giltay培养基中分别接入2%的前培养菌液，30℃、每分钟120转摇床培养2d后，观察培养基产气与颜色变化情况以及测定培养液中氨态氮、亚硝态氮、硝态氮与总氮。

氨氮、亚硝态氮、硝态氮与总氮分别采用奈氏比色法、紫外分光光度法、国标水质总氮测定法（GB11894-89水质总氮的测定碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法）测定。结果见图2。观测到接种可培养化VBNC节杆菌DSC4菌株可使Giltay培养基反应液开始由绿色转为深蓝色并见产气现象，说明该菌种能利用硝酸盐还原形成碱性物质，并产气使指示剂颜色变化。同时测得硝态氮转化率为54.7%，总氮减少率为52.9%，未检测到氨态氮与亚硝态氮的残存。